Budowa i główne części mikroskopu optycznego. Mikroskop jako układ optyczny Cel mikroskopu optycznego

17.04.2024 -

Jak wiadomo, człowiek otrzymuje większość informacji o otaczającym go świecie poprzez wizję. Ludzkie oko jest złożonym i doskonałym urządzeniem. To stworzone przez naturę urządzenie współpracuje ze światłem – promieniowaniem elektromagnetycznym, którego zakres długości fal mieści się w przedziale od 400 do 760 nanometrów. Kolor postrzegany przez osobę zmienia się z fioletowego na czerwony.

Fale elektromagnetyczne odpowiadające światłu widzialnemu oddziałują z elektronicznymi powłokami atomów i cząsteczek w oku. Wynik tej interakcji zależy od stanu elektronów w tych powłokach. Światło może zostać pochłonięte, odbite lub rozproszone. To, co dokładnie stało się ze światłem, może wiele powiedzieć o atomach i cząsteczkach, z którymi wchodziło w interakcję. Zakres rozmiarów atomów i cząsteczek wynosi od 0,1 do kilkudziesięciu nanometrów. Jest to wielokrotnie krótsza długość fali światła. Jednak obiekty dokładnie tej wielkości – nazwijmy je nanoobiektami – są bardzo ważne do zobaczenia. Co należy w tym celu zrobić? Omówmy najpierw, co widzi ludzkie oko.

Zwykle mówiąc o rozdzielczości konkretnego urządzenia optycznego, operują dwoma pojęciami. Jedna to rozdzielczość kątowa, a druga to rozdzielczość liniowa. Pojęcia te są ze sobą powiązane. Na przykład dla ludzkiego oka rozdzielczość kątowa wynosi około 1 minuty łuku. W tym przypadku oko jest w stanie rozróżnić dwa obiekty punktowe oddalone od niego o 25–30 cm dopiero wtedy, gdy odległość między tymi obiektami jest większa niż 0,075 mm. Jest to porównywalne z rozdzielczością konwencjonalnego skanera komputerowego. W rzeczywistości rozdzielczość 600 dpi oznacza, że skaner może rozróżnić punkty oddalone od siebie o zaledwie 0,042 mm.

Aby móc rozróżniać obiekty znajdujące się w jeszcze mniejszych odległościach od siebie, wynaleziono mikroskop optyczny – urządzenie zwiększające rozdzielczość oka. Urządzenia te różnią się wyglądem (jak widać na rysunku 1), ale zasada działania jest taka sama. Mikroskop optyczny umożliwił przesunięcie granicy rozdzielczości do ułamków mikrona. Już 100 lat temu mikroskopia optyczna umożliwiła badanie obiektów o rozmiarach mikronowych. Jednocześnie jednak stało się jasne, że nie da się osiągnąć dalszego wzrostu rozdzielczości poprzez zwykłe zwiększenie liczby obiektywów i poprawę ich jakości. Rozdzielczość mikroskopu optycznego okazała się ograniczona właściwościami samego światła, a mianowicie jego falową naturą.

Pod koniec ubiegłego wieku ustalono, że rozdzielczość mikroskopu optycznego wynosi . W tym wzorze λ jest długością fali światła i N grzech ty- apertura numeryczna soczewki mikroskopu, która charakteryzuje zarówno mikroskop, jak i substancję znajdującą się pomiędzy przedmiotem badań a najbliższą mu soczewką mikroskopu. Rzeczywiście, wyrażenie na aperturę numeryczną obejmuje współczynnik załamania światła N otoczenie pomiędzy obiektem a soczewką oraz kąt ty pomiędzy osią optyczną soczewki a najbardziej zewnętrznymi promieniami wychodzącymi z obiektu i mogącymi dostać się do soczewki. Współczynnik załamania próżni jest równy jedności. Dla powietrza wskaźnik ten jest bardzo bliski jedności, dla wody wynosi 1,33303, a dla specjalnych cieczy stosowanych w mikroskopii w celu uzyskania maksymalnej rozdzielczości, N osiąga 1,78. Niezależnie od kąta ty, wartość grzechu ty nie może być więcej niż jeden. Zatem rozdzielczość mikroskopu optycznego nie przekracza ułamka długości fali światła.

Rozdzielczość jest powszechnie uważana za połowę długości fali.

Intensywność, rozdzielczość i powiększenie obiektu to różne rzeczy. Można to zrobić tak, aby odległość między środkami obrazów obiektów oddalonych od siebie o 10 nm wynosiła 1 mm. Odpowiadałoby to wzrostowi 100 000-krotnemu. Nie będzie jednak możliwe rozróżnienie, czy jest to jeden obiekt, czy dwa. Faktem jest, że obrazy obiektów, których wymiary są bardzo małe w porównaniu z długością fali światła, będą miały ten sam kształt i rozmiar, niezależnie od kształtu samych obiektów. Takie obiekty nazywane są obiektami punktowymi - ich rozmiary można pominąć. Jeśli taki punktowy obiekt świeci, mikroskop optyczny przedstawi go jako jasny okrąg otoczony jasnymi i ciemnymi pierścieniami. Dalej, dla uproszczenia, rozważymy źródła światła. Typowy obraz punktowego źródła światła uzyskany za pomocą mikroskopu optycznego pokazano na rysunku 2. Natężenie pierścieni świetlnych jest znacznie mniejsze niż w okręgu i maleje wraz z odległością od środka obrazu. Najczęściej widoczny jest tylko pierwszy pierścień świetlny. Średnica pierwszego ciemnego pierścienia wynosi . Funkcja opisująca ten rozkład intensywności nazywana jest funkcją rozproszenia punktowego. Funkcja ta nie zależy od powiększenia. Obraz kilku obiektów punktowych będzie dokładnie przypominał okręgi i pierścienie, jak widać na rysunku 3. Powstały obraz można powiększyć, jednak jeśli obrazy dwóch sąsiednich obiektów punktowych się połączą, będą one nadal się łączyć. Często mówi się, że tego rodzaju powiększenie jest bezużyteczne – większe obrazy będą po prostu bardziej nieostre. Przykład bezużytecznego powiększenia pokazano na rysunku 4. Wzór ten nazywany jest często granicą dyfrakcyjną i jest tak sławny, że został wyryty na pomniku autora tego wzoru, niemieckiego fizyka optycznego Ernsta Abbe.

Oczywiście z biegiem czasu mikroskopy optyczne zaczęto wyposażać w różnorodne urządzenia umożliwiające przechowywanie obrazów. Oko ludzkie zostało najpierw uzupełnione aparatami i kliszami filmowymi, a następnie aparatami opartymi na urządzeniach cyfrowych, które przetwarzają padające na nie światło na sygnały elektryczne. Najpopularniejszymi z tych urządzeń są matryce CCD (CCD oznacza urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym). Liczba pikseli w aparatach cyfrowych stale rośnie, ale samo to nie jest w stanie poprawić rozdzielczości mikroskopów optycznych.

Jeszcze dwadzieścia pięć lat temu wydawało się, że granica dyfrakcyjna jest nie do pokonania i że aby badać obiekty, których wymiary są wielokrotnie mniejsze od długości fali światła, trzeba porzucić światło jako takie. Tą właśnie drogą poszli twórcy mikroskopów elektronowych i rentgenowskich. Pomimo licznych zalet takich mikroskopów, problem wykorzystania światła do obserwacji nanoobiektów pozostał. Powodów było wiele: wygoda i łatwość pracy z obiektami, krótki czas potrzebny na uzyskanie obrazu, znane metody kolorowania próbek i wiele innych. Wreszcie, po latach ciężkiej pracy, możliwe stało się oglądanie obiektów w nanoskali za pomocą mikroskopu optycznego. Największy postęp w tym kierunku osiągnięto w dziedzinie mikroskopii fluorescencyjnej. Oczywiście nikt nie zniósł limitu dyfrakcji, ale udało się go obejść. Obecnie istnieją różne mikroskopy optyczne, które umożliwiają badanie obiektów, których wymiary są znacznie mniejsze niż długość fali samego światła tworzącego obrazy tych obiektów. Wszystkie te urządzenia mają jedną wspólną zasadę. Spróbujmy wyjaśnić, który to jest.

Z tego, co już powiedziano na temat dyfrakcyjnej granicy rozdzielczości, jasne jest, że dostrzeżenie źródła punktowego nie jest takie trudne. Jeśli źródło to będzie miało wystarczającą intensywność, jego obraz będzie wyraźnie widoczny. O kształcie i rozmiarze tego obrazu, jak już wspomniano, zadecydują właściwości układu optycznego. Jednocześnie znając właściwości układu optycznego i mając pewność, że obiekt jest obiektem punktowym, można dokładnie określić, gdzie obiekt się znajduje. Dokładność określenia współrzędnych takiego obiektu jest dość wysoka. Można to zilustrować na rysunku 5. Współrzędne obiektu punktowego można określić dokładniej, im intensywniej on świeci. Jeszcze w latach 80. ubiegłego wieku za pomocą mikroskopu optycznego udało się określić położenie poszczególnych cząsteczek świecących z dokładnością do 10–20 nanometrów. Warunkiem koniecznym tak dokładnego określenia współrzędnych źródła punktowego jest jego samotność. Najbliższe inne źródło punktowe musi znajdować się na tyle daleko, aby badacz miał pewność, że przetwarzany obraz odpowiada jednemu źródłu. Wiadomo, że jest to odległość l musi spełniać warunek. W tym przypadku analiza obrazu może dostarczyć bardzo precyzyjnych danych na temat położenia samego źródła.

Większość obiektów, których wymiary są znacznie mniejsze niż rozdzielczość mikroskopu optycznego, można przedstawić jako zbiór źródeł punktowych. Źródła światła w takim zestawie znajdują się od siebie w odległościach znacznie mniejszych niż . Jeśli te źródła świecą jednocześnie, nie będzie można powiedzieć nic o tym, gdzie dokładnie się znajdują. Jeśli jednak uda ci się sprawić, by te źródła świeciły po kolei, wtedy położenie każdego z nich będzie można określić z dużą dokładnością. Jeśli dokładność ta przekracza odległość między źródłami, to znając położenie każdego z nich, można dowiedzieć się, jakie jest ich względne położenie. Oznacza to, że uzyskano informację o kształcie i wielkości obiektu, która jest przedstawiona jako zbiór źródeł punktowych. Innymi słowy, w tym przypadku można zbadać za pomocą mikroskopu optycznego obiekt, którego wymiary są mniejsze niż granica dyfrakcyjna!

Kluczowe jest zatem uzyskanie informacji o różnych częściach nanoobiektu niezależnie od siebie. Można to osiągnąć trzema głównymi grupami metod.

Pierwsza grupa metod celowo nadaje połysk tej lub innej części badanego obiektu. Najbardziej znaną z tych metod jest skaningowa mikroskopia optyczna bliskiego pola. Przyjrzyjmy się temu bliżej.

Jeśli dokładnie przestudiujesz warunki związane z granicą dyfrakcji, odkryjesz, że odległości obiektów od soczewek są znacznie większe niż długość fali światła. W odległościach porównywalnych i mniejszych od tej długości fali obraz jest inny. W pobliżu każdego obiektu znajdującego się w polu elektromagnetycznym fali świetlnej występuje zmienne pole elektromagnetyczne, którego częstotliwość zmian jest taka sama jak częstotliwość zmian pola fali świetlnej. W przeciwieństwie do fali świetlnej pole to szybko zanika w miarę oddalania się od nanoobiektu. Odległość, przy której zmniejsza się intensywność, np.: mi razy porównywalne z wielkością obiektu. Zatem pole elektromagnetyczne o częstotliwości optycznej koncentruje się w objętości przestrzeni, której rozmiar jest znacznie mniejszy niż długość fali światła. Każdy nanoobiekt, który wpadnie w ten obszar, będzie w taki czy inny sposób oddziaływać ze skoncentrowanym polem. Jeśli obiekt, za pomocą którego przeprowadza się tę koncentrację pola, zostanie sekwencyjnie przesunięty po dowolnej trajektorii wzdłuż badanego nanoobiektu i zarejestrowane zostanie światło emitowane przez ten układ, wówczas z poszczególnych punktów leżących na tej trajektorii można zbudować obraz. Oczywiście w każdym punkcie obraz będzie wyglądał tak, jak pokazano na rysunku 2, ale rozdzielczość będzie zależeć od stopnia koncentracji pola. A to z kolei zależy od wielkości obiektu, za pomocą którego koncentruje się to pole.

Najczęstszym sposobem koncentracji pola w ten sposób jest wykonanie bardzo małego otworu w metalowym ekranie. Zazwyczaj otwór ten znajduje się na końcu spiczastego światłowodu pokrytego cienką warstwą metalu (światłowód jest często nazywany światłowodem i jest szeroko stosowany do przesyłania danych na duże odległości). Obecnie możliwe jest wytwarzanie otworów o średnicach od 30 do 100 nm. Rozdzielczość ma tę samą wielkość. Urządzenia działające na tej zasadzie nazywane są skaningowymi mikroskopami optycznymi bliskiego pola. Pojawiły się 25 lat temu.

Istota drugiej grupy metod sprowadza się do następujących kwestii. Zamiast sprawiać, że pobliskie nanoobiekty świecą po kolei, możesz użyć obiektów świecących w różnych kolorach. W takim przypadku za pomocą filtrów świetlnych, które przepuszczają światło tego lub innego koloru, można określić położenie każdego obiektu, a następnie utworzyć pojedynczy obraz. Jest to bardzo podobne do tego, co pokazano na rysunku 5, tylko kolory będą inne na trzech obrazach.

Ostatnia grupa metod umożliwiających pokonanie granicy dyfrakcyjnej i badanie nanoobiektów wykorzystuje właściwości samych obiektów świetlistych. Istnieją źródła, które można „włączyć” i „wyłączyć” za pomocą specjalnie dobranego światła. Takie przełączenia występują statystycznie. Innymi słowy, jeśli przełączalnych nanoobiektów jest wiele, to wybierając długość fali światła i jego natężenie, można zmusić tylko część tych obiektów do „wyłączenia”. Pozostałe obiekty będą nadal świecić i będzie można uzyskać z nich obraz. Następnie musisz „włączyć” wszystkie źródła i ponownie „wyłączyć” niektóre z nich. Zestaw źródeł, które pozostaną „włączone”, będzie inny niż zestaw, który pozostał „włączony” za pierwszym razem. Powtarzając tę procedurę wiele razy, możesz uzyskać duży zestaw obrazów, które różnią się od siebie. Analizując taki zbiór, można zlokalizować dużą część wszystkich źródeł z bardzo dużą dokładnością, znacznie powyżej granicy dyfrakcyjnej. Przykład uzyskanej w ten sposób superrozdzielczości pokazano na rysunku 6.

Mikroskopia optyczna o super rozdzielczości rozwija się obecnie szybko. Można śmiało założyć, że w nadchodzących latach obszar ten będzie przyciągał coraz większą liczbę badaczy i mamy nadzieję, że wśród nich znajdą się także czytelnicy niniejszego artykułu.

Wykład nr 7

Metody renderowania powierzchni

Mikroskopia optyczna

Ludzkie oko, które pozwala nam widzieć i badać otaczający nas świat, to dość prosty układ optyczny, którego głównym elementem jest soczewka, która w rzeczywistości jest soczewką wykonaną z substancji ciekłokrystalicznej. Najmniejsze obiekty, które można zobaczyć za pomocą takiego układu optycznego, mają wielkość około 0,1 mm, a do oglądania i badania mniejszych obiektów używano najpierw okularów lub szkieł powiększających, a następnie skomplikowanych konstrukcji wykonanych z soczewek optycznych, zwanych mikroskopami optycznymi.

Mikroskop (z greckiego mikros – mały i skopeo – patrzę) – urządzenie umożliwiające uzyskanie bardzo powiększonych obrazów obiektów (lub szczegółów ich budowy) niewidocznych gołym okiem.

Budowa optyczna i zasada działania mikroskopu optycznego . Jeden z typowych schematów mikroskopu optycznego pokazano na ryc. 1. Obiekt 7 umieszczony na stoliku 10 zwykle oświetla się sztucznym światłem z oświetlacza (lampy 1 i soczewki zbierającej 2) za pomocą zwierciadła 4 i kondensora 6. Aby powiększyć obiekt, stosuje się soczewkę 8 i okular 9 używany obiektyw tworzy rzeczywisty, odwrócony i powiększony 7-calowy obraz obiektu 7. Okular tworzy wtórnie powiększony wirtualny obraz 7-calowy, zwykle przy najlepszej odległości widzenia D=250 mm. Jeżeli okular przesuniemy w taki sposób, że obraz 7" znajdzie się przed przednim ogniskiem okularu F w przybliżeniu F, wówczas obraz podawany przez okular staje się rzeczywisty i można go uzyskać na ekranie lub kliszy. Całkowite powiększenie jest równe iloczyn powiększenia soczewki przez powiększenie okularu: x = bX ok. Powiększenie soczewki wyraża się wzorem: b=D/F ob, gdzie D jest odległością pomiędzy tylnym ogniskiem soczewki F ob a przednim ogniskiem obiektywu okular F ok (tzw. długość optyczna tubusu mikroskopu); F ob to ogniskowa soczewki. Powiększenie okularu jest podobne do powiększenia szkła powiększającego i wyrażane jest wzorem: X ok = 250/F ok, gdzie F ok to ogniskowa okularu. Zwykle soczewki mikroskopów optycznych mają powiększenia od 6,3 do 100, a okulary od 7 do 15. Zatem całkowite powiększenie takiego mikroskopu waha się od 44 do 15. 100. 1500. Przysłona polowa 3 i apertura 5 służą do ograniczenia strumienia światła i redukcji światła rozproszonego. Ważną cechą mikroskopu optycznego jest jego rozdzielczość, definiowana jako odwrotność najmniejszej odległości, z której dwa sąsiednie elementy konstrukcyjne można nadal widzieć osobno. Rozdzielczość mikroskopu optycznego jest ograniczona ze względu na dyfrakcję światła. Ze względu na dyfrakcję obraz nieskończenie małego punktu świetlnego, dany przez soczewkę takiego mikroskopu, nie wygląda jak punkt, ale okrągły dysk świetlny (otoczony ciemnymi i jasnymi pierścieniami), którego średnica jest równa: d = 1,22 /A, Gdzie  – długość fali światła i A–apertura numeryczna obiektywu równa: A =Ngrzech (a/2)(N– współczynnik załamania ośrodka znajdującego się pomiędzy przedmiotem a soczewką, A- kąt pomiędzy skrajnymi promieniami stożkowej wiązki światła wychodzącej z punktu na przedmiocie i wchodzącej do soczewki). Jeżeli dwa punkty świetlne znajdują się blisko siebie, ich wzory dyfrakcyjne nakładają się na siebie, dając złożony rozkład oświetlenia w płaszczyźnie obrazu. Najmniejsza względna różnica w oświetleniu, jaką można zobaczyć gołym okiem, wynosi 4%. Odpowiada to najmniejszej odległości rozdzielonej w mikroskopie optycznym, d=0,51 /A. W przypadku obiektów niesamoświecących maksymalna rozdzielczość wynosi D itp wynosi  /(A+A"), Gdzie A"– apertura numeryczna kondensora mikroskopu. Tym samym uchwała ( 1/d) jest wprost proporcjonalna do apertury obiektywu i aby ją zwiększyć, przestrzeń pomiędzy przedmiotem a soczewką wypełnia się cieczą o wysokim współczynniku załamania światła. Osiągają apertury obiektywów immersyjnych o dużym powiększeniu A=1,3 (dla konwencjonalnych soczewek „suchych”. A=0,9). Istnienie granicy rozdzielczości wpływa na wybór powiększenia mikroskopu optycznego. Powiększenie mikroskopu optycznego w zakresie 500 A – 1000A nazywa się użytecznym, ponieważ dzięki niemu oko rozróżnia wszystkie elementy struktury obiektu rozpoznawane przez mikroskop. Przy powiększeniach powyżej 1000 A nie ujawniono żadnych nowych szczegółów dotyczących budowy obiektu; Czasami jednak takie powiększenia wykorzystuje się np. w mikrofotografii i mikroprojekcji.

Metody obserwacyjne w mikroskopii optycznej . Strukturę obiektu można rozróżnić, jeśli różne jego części w różny sposób absorbują i odbijają światło lub mają różne współczynniki załamania światła względem siebie (lub ośrodka). Właściwości te określają różnicę w amplitudach i fazach fal świetlnych odbitych lub przechodzących przez różne części obiektu, co z kolei decyduje o kontraście obrazu. Dlatego metody obserwacji stosowane w mikroskopii optycznej dobiera się w zależności od charakteru i właściwości badanego obiektu.

Metoda transmitowanego pola świetlnego stosowany podczas badania przezroczystych obiektów z cząsteczkami pochłaniającymi (pochłaniającymi światło) i zawartymi w nich częściami. Są to na przykład cienkie kolorowe skrawki tkanek zwierzęcych i roślinnych, cienkie skrawki minerałów i materiałów radioelektronicznych. W przypadku braku obiektu wiązka promieni z kondensora 6 (patrz rys. 1) przechodzi przez soczewkę 8 i wytwarza równomiernie oświetlone pole w pobliżu płaszczyzny ogniskowej okularu 9. Jeżeli obiekt 7 zawiera obiekt pochłaniający, to częściowo pochłania i częściowo rozprasza padające na nią światło (linia przerywana), co zgodnie z teorią dyfrakcji decyduje o wyglądzie obrazu. Metoda może być przydatna także w przypadku obiektów nieabsorbujących, jeśli rozpraszają one wiązkę oświetlającą na tyle mocno, że znaczna część wiązki nie dociera do soczewki.

Metoda jasnego pola w świetle odbitym(rys. 2) służy do obserwacji obiektów nieprzezroczystych, np. kształtowników metalowych 4.

Obiekt jest oświetlany z oświetlacza 1 i półprzezroczystego lustra 2 od góry przez soczewkę 3, która jednocześnie służy jako kondensor. Obraz tworzony jest w płaszczyźnie 6 przez soczewkę wraz z soczewką tubusową 5; struktura obiektu jest widoczna dzięki różnicom w odbiciu jego elementów; W jasnym polu wyróżniają się niejednorodności, rozpraszając padające na nie światło.

Metoda światła przechodzącego i ciemnego pola(ryc. 3) służy do uzyskiwania obrazów obiektów przezroczystych, nieabsorbujących. Światło z oświetlacza 1 i zwierciadła 2 przechodzi przez specjalny kondensator ciemnego pola 3 w postaci pustego stożka i nie wchodzi bezpośrednio do soczewki 5. Obraz tworzony jest jedynie przez światło rozproszone przez mikrocząstki obiektu 4. W polu widzenia 6, na ciemnym tle, widoczne są jasne obrazy cząstek różniących się od otoczenia współczynnikiem załamania światła.

Metoda ultramikroskopowa na tej samej zasadzie (oświetlenie obiektu w ultramikroskopach jest prostopadłe do kierunku obserwacji), pozwala wykryć ultradrobne szczegóły, których wymiary (2 nm) znacznie przekraczają rozdzielczość mikroskopu optycznego . Zdolność do wykrywania takich obiektów, np. najmniejszych cząstek koloidalnych, za pomocą ultramikroskopu, wynika z dyfrakcji przez nie światła. Przy silnym oświetleniu bocznym każda cząstka w ultramikroskopie jest oznaczana przez obserwatora jako jasny punkt (świetlna plamka dyfrakcyjna) na ciemnym tle. Z powodu dyfrakcji bardzo mało światła jest rozpraszane przez najmniejsze cząstki. Dlatego w ultramikroskopii zwykle wykorzystuje się silne źródła światła. W zależności od natężenia oświetlenia, długości fali światła i różnicy między współczynnikami załamania światła cząstki i ośrodka, wykryte cząstki mają rozmiary (2–50) nm. Na podstawie plam dyfrakcyjnych nie da się określić prawdziwego rozmiaru, kształtu i struktury cząstek: ultramikroskop nie daje obrazu badanych obiektów optycznych. Jednakże za pomocą ultramikroskopu można określić obecność i stężenie liczbowe cząstek, zbadać ich ruch, a także obliczyć średnią wielkość cząstek, jeśli znane jest ich stężenie wagowe i gęstość. Ultramikroskop powstał w 1903 roku. Niemiecki fizyk G. Siedentopf i austriacki chemik R. Zsigmondy. Na zaproponowanym przez nich schemacie ultramikroskopu szczelinowego (ryc. 4, a) badany układ jest nieruchomy. Kuweta 5 z badanym obiektem oświetlana jest źródłem światła 1 (2 – kondensor; 4 – soczewka oświetlająca) przez wąską prostokątną szczelinę 3, której obraz rzutowany jest w strefę obserwacji.

Przez okular mikroskopu obserwacyjnego nr 6 widoczne są punkty świetlne cząstek znajdujące się w płaszczyźnie obrazu szczeliny. Powyżej i poniżej oświetlonej strefy nie wykrywa się obecności cząstek. W ultramikroskopie przepływowym (ryc. 4, b) badane cząstki przemieszczają się wzdłuż rurki w kierunku oka obserwatora. Gdy przekraczają strefę oświetlenia, są wykrywane wizualnie lub za pomocą urządzenia fotometrycznego w postaci jasnych błysków. Regulując jasność oświetlenia obserwowanych cząstek za pomocą ruchomego klina fotometrycznego 7, istnieje możliwość selekcji do rejestracji cząstek, których wielkość przekracza zadaną granicę. Ultramikroskopy wykorzystywane są w badaniach układów rozproszonych, do monitorowania czystości powietrza atmosferycznego, wody oraz stopnia zanieczyszczenia optycznie przezroczystych ośrodków obcymi wtrąceniami.

Podczas obserwacji metoda ciemnego pola w świetle odbitym(ryc. 5) obiekty nieprzezroczyste (np. profile metalowe) są oświetlane od góry specjalnym systemem pierścieni umieszczonym wokół soczewki i zwanym epikondensator.

Promienie światła z lampy 1 oświetlacza ciemnego pola, odbite od epikondensatora 2 i padające pod kątem na powierzchnię podłoża 3, są rozpraszane przez ciała obce. Te promienie świetlne rozproszone od ciał obcych przechodzą przez soczewki obiektywowe 4 i 5 mikroskopu, odbijają się od zwierciadła pryzmatycznego mikroskopu 6 i przechodząc przez soczewkę okularu mikroskopu 7, są rozróżniane przez obserwatora w postaci świecących punktów w ciemnym polu .

Metoda obserwacji światła spolaryzowanego(przepuszczana i odbita) służy do badania obiektów anizotropowych, takich jak minerały, rudy, ziarna w cienkich przekrojach stopów, niektóre tkanki i komórki zwierzęce i roślinne. Anizotropia optyczna to różnica właściwości optycznych ośrodka w zależności od kierunku propagacji w nim promieniowania optycznego (światła) i jego polaryzacji. Polaryzacja światła to fizyczna cecha promieniowania optycznego, która opisuje anizotropię poprzeczną fal świetlnych, czyli nierównoważność różnych kierunków w płaszczyźnie prostopadłej do wiązki światła. Poprzeczny charakter fal elektromagnetycznych pozbawia falę symetrii osiowej względem kierunku propagacji ze względu na obecność wybranych kierunków (wektorów mi– pole elektryczne i siła wektora N– natężenie pola magnetycznego) w płaszczyźnie prostopadłej do kierunku propagacji. Ponieważ wektory mi I N fale elektromagnetyczne są do siebie prostopadłe, aby w pełni opisać stan polaryzacji wiązki światła, wymagana jest znajomość zachowania tylko jednej z nich. Zwykle wybiera się w tym celu wektor E. Światło emitowane przez dowolny elementarny emiter (atom, cząsteczkę) jest zawsze spolaryzowane w każdym akcie promieniowania. Jednak makroskopowe źródła światła składają się z ogromnej liczby takich cząstek emitujących; orientacje przestrzenne wektorów mi a momenty aktów emisji światła przez poszczególne cząstki w większości przypadków rozkładają się chaotycznie. Dlatego ogólnie promieniowanie ma kierunek mi nieprzewidywalne w dowolnym momencie. Takie promieniowanie nazywa się niespolaryzowany lub naturalne światło. Światło nazywa się w pełni spolaryzowany, jeżeli dwie wzajemnie prostopadłe składowe (rzuty) wektora mi Wiązka światła oscyluje ze stałą różnicą faz w czasie. Zazwyczaj stan polaryzacji światła jest przedstawiany za pomocą elipsy polaryzacyjnej - rzutu trajektorii końca wektora mi do płaszczyzny prostopadłej do belki (rys. 6)

Anizotropia optyczna objawia się dwójłomnością, zmianami polaryzacji światła i rotacją płaszczyzny polaryzacji zachodzącą w substancjach optycznie czynnych. Naturalna anizotropia optyczna kryształów wynika z odmienności w różnych kierunkach pola sił łączących atomy sieci. Naturalna aktywność optyczna substancji ją wykazujących w dowolnym stanie skupienia jest związana z asymetrią struktury poszczególnych cząsteczek takich substancji i wynikającą z tego różnicą w oddziaływaniu tych cząsteczek z promieniowaniem o różnej polaryzacji, a także z charakterystyką stanów wzbudzonych elektronów i „rdzeni jonowych” w kryształach optycznie aktywnych. Indukowana (sztuczna) anizotropia optyczna występuje w ośrodkach, które są naturalnie izotropowe optycznie pod wpływem pól zewnętrznych, które podkreślają określony kierunek w tych ośrodkach. Może to być pole elektryczne, pole magnetyczne, pole sił sprężystych, a także pole sił w przepływie płynu. W metodzie obserwacji światła spolaryzowanego za pomocą analizatorów i kompensatorów wchodzących w skład układu optycznego bada się zmianę polaryzacji światła przechodzącego przez obiekt.

Metoda kontrastu fazowego służy do uzyskiwania obrazów obiektów przezroczystych i bezbarwnych, które są niewidoczne przy obserwacji metodą jasnego pola. Takimi przedmiotami są na przykład żywa, niebarwiona tkanka zwierzęca. Metoda polega na tym, że nawet przy niewielkiej różnicy współczynników załamania przedmiotu i ośrodka przechodząca przez nie fala świetlna ulega różnym zmianom fazowym i nabiera ulga fazowa. Te zmiany fazowe są przekształcane na zmiany jasności („relief amplitudy”) za pomocą specjalnej płytki fazowej (pierścienia fazowego) umieszczonej w pobliżu tylnego ogniska obiektywu. Promienie przechodzące przez obiekt przechodzą całkowicie przez pierścień fazowy, który zmienia ich fazę o /4. Jednocześnie promienie rozproszone w obiekcie (odbite) nie wpadają do pierścienia fazowego i nie ulegają dodatkowemu przesunięciu fazowemu. Uwzględniając przesunięcie fazowe w obiekcie, różnica faz pomiędzy promieniami odchylonymi i nieodchylonymi okazuje się bliska 0 lub /2, a w wyniku interferencji światła w płaszczyznę obrazową obiektu, wyraźnie się wzmacniają lub osłabiają, dając kontrastowy obraz struktury obiektu, w którym rozkład jasności odwzorowuje powyższy relief fazowy.

Metoda kontrastu interferencyjnego polega na tym, że każda wiązka wpadająca do mikroskopu ulega rozwidleniu: jedna przechodzi przez obserwowaną cząstkę, a druga obok niej. W części okularowej mikroskopu obie wiązki są ponownie połączone i zakłócają się nawzajem. Wynik interferencji zależy od różnicy w drodze promieni D, co wyraża się wzorem: d=N =(n 0 -N M )D 0 , gdzie n 0 , nm są współczynnikami załamania światła odpowiednio cząstki i otoczenia, D 0 – grubość cząstek, N– kolejność ingerencji. Schemat ideowy jednej z metod realizacji kontrastu interferencyjnego pokazano na ryc. 4. Kondensator 1 i soczewka 4 wyposażone są w płytki dwójłomne (zaznaczone na rysunku ukośnymi strzałkami), z których pierwsza rozdziela pierwotną wiązkę światła na dwie wiązki, a druga je łączy. Jeden z promieni przechodzących przez obiekt 3 jest opóźniony w fazie (nabywa różnicę drogi w porównaniu z drugim promieniem); wielkość tego opóźnienia mierzy kompensator 5. Metoda kontrastu interferencyjnego jest pod pewnymi względami podobna do metody kontrastu fazowego - obie opierają się na interferencji promieni, które przeszły przez mikrocząstkę i przeszły przez nią. Różnica pomiędzy metodą interferencyjną a metodą kontrastu fazowego polega przede wszystkim na możliwości pomiaru z dużą dokładnością (do /300) różnic dróg wprowadzonych przez mikroobiekt za pomocą kompensatorów. Na podstawie tych pomiarów można dokonać obliczeń ilościowych np. masy całkowitej i stężenia suchej masy w komórkach obiektów biologicznych.

Metoda badań w świetle luminescencyjnym opiera się na fakcie, że pod mikroskopem bada się zielono-pomarańczową poświatę przedmiotu, która pojawia się pod wpływem oświetlenia niebiesko-fioletowego lub światła UV. W tym celu przed kondensorem i za soczewką mikroskopu wprowadza się odpowiednie filtry świetlne. Pierwsza z nich przepuszcza jedynie promieniowanie ze źródła oświetlacza wywołujące luminescencję obiektu, druga (za soczewką) przekazuje do oka obserwatora jedynie światło luminescencji. Metodę tę wykorzystuje się w analizie mikrochemicznej i wykrywaniu wad.

Metoda obserwacji UV pozwala na zwiększenie maksymalnej rozdzielczości mikroskopu, proporcjonalnie do 1/. Metoda ta poszerza także możliwości badań mikroskopowych ze względu na fakt, że cząstki wielu substancji, przezroczyste w świetle widzialnym, silnie absorbują promieniowanie UV o określonych długościach fal, dzięki czemu są łatwo rozpoznawalne na obrazach UV. Obrazy w mikroskopii UV rejestruje się za pomocą fotografii lub przy użyciu konwertera elektronowo-optycznego lub ekranu luminescencyjnego.

Metoda obserwacji w podczerwieni wymaga także zamiany obrazu niewidzialnego dla oka na widzialny poprzez jego sfotografowanie lub zastosowanie przetwornika elektronowo-optycznego. Mikroskopia w podczerwieni umożliwia badanie wewnętrznej struktury obiektów nieprzezroczystych w świetle widzialnym, na przykład ciemnych okularów, niektórych kryształów i minerałów.

Główne elementy mikroskopu optycznego . Oprócz powyższych elementów optycznych (na przykład soczewki, okularu) mikroskop optyczny ma również statyw lub korpus, stolik do montażu badanego obiektu, mechanizmy zgrubnego i dokładnego ogniskowania, urządzenie do mocowania soczewek i tubus do montażu okularów. Zastosowanie tego lub innego typu kondensatora (jasnego pola, ciemnego pola itp.) zależy od wyboru wymaganej metody obserwacji. Soczewki w większości nowoczesnych mikroskopów optycznych są zdejmowane. Soczewki różnią się:

a) według charakterystyki spektralnej - dla soczewek do zakresu widzialnego widma oraz do mikroskopii UV i IR (soczewka i soczewka lustrzana);

b) wzdłuż długości tubusu, dla którego są przeznaczone (w zależności od konstrukcji mikroskopu);

c) w zależności od ośrodka pomiędzy soczewką a przedmiotem – suchy i immersyjny;

G ) zgodnie z metodą obserwacji - na konwencjonalny, kontrast fazowy itp.

Rodzaj okularu stosowanego w tej metodzie obserwacji zależy od wyboru soczewki mikroskopu optycznego. Przystosowania do mikroskopów optycznych pozwalają na poprawę warunków obserwacji i poszerzenie możliwości badawczych, przeprowadzanie różnego rodzaju oświetlania obiektów, określanie wielkości obiektów, fotografowanie obiektów przez mikroskop itp. Rodzaje mikroskopów określane są albo przez powierzchnię aplikacja lub metoda obserwacji. Na przykład, mikroskopy biologiczne przeznaczony do badań w mikrobiologii, histologii, cytologii, botanice, medycynie, a także do obserwacji obiektów przezroczystych w fizyce, chemii itp. Mikroskopy metalograficzne przeznaczony do badania mikrostruktur metali i stopów. Mikrofotografie niewytrawionego przekroju metalu wykonane za pomocą takiego mikroskopu pokazano na ryc. 5 (a – w jasnym polu, b – z urządzeniem z kontrastem fazowym). Mikroskopy polaryzacyjne są wyposażone w dodatkowe urządzenia polaryzacyjne i przeznaczone są głównie do badania cienkich przekrojów minerałów i rud. Stereomikroskopy służą do uzyskania trójwymiarowych obrazów obserwowanych obiektów. Mikroskopy pomiarowe Przeznaczone do różnych precyzyjnych pomiarów w inżynierii mechanicznej. Oprócz tych grup mikroskopów istnieją specjalistyczne mikroskopy optyczne, np.: mikroinstalacja do filmowania szybkich i wolnych procesów (ruch mikroorganizmów, procesy podziału komórek, wzrostu kryształów itp.); mikroskopy wysokotemperaturowe do badania obiektów nagrzanych do 2000°C; mikroskopy chirurgiczne o małym powiększeniu, używany podczas operacji. Bardzo złożonymi przyrządami są instalacje mikrospektrofotometryczne do wyznaczania widm absorpcyjnych obiektów, telewizyjne analizatory mikroobrazów itp.

Jak już wspomniano, niezależnie od rodzaju zastosowanych soczewek i sposobu ich łączenia, rozdzielczość mikroskopów optycznych ograniczona jest podstawową zasadą techniki optycznej, sformułowaną jeszcze w 1873 roku. (tzw. granica rozdzielczości dyfrakcyjna Rayleigha), zgodnie z którą minimalne wymiary rozróżnialnych szczegółów rozpatrywanego obiektu nie mogą być mniejsze niż połowa długości fali światła użytego do oświetlenia. Ponieważ najkrótsze długości fali w tym zakresie odpowiadają w przybliżeniu 400 nm, rozdzielczość mikroskopów optycznych jest zasadniczo ograniczona do połowy tej wartości, czyli około 200 nm. Jedynym wyjściem z tej sytuacji było stworzenie urządzeń wykorzystujących promieniowanie falowe o krótszej długości fali, czyli promieniowanie o charakterze nielekkim.

Mikroskopia elektronowa

W mechanice kwantowej elektron można uznać za falę, na którą z kolei mogą wpływać soczewki elektryczne lub magnetyczne (całkowicie analogicznie do praw konwencjonalnej optyki geometrycznej). Na tym opiera się zasada działania mikroskopów elektronowych, które pozwalają znacznie rozszerzyć możliwości badania materii na poziomie mikroskopowym (poprzez zwiększenie rozdzielczości o rzędy wielkości). W mikroskopie elektronowym zamiast światła wykorzystuje się same elektrony, które w tej sytuacji reprezentują promieniowanie o znacznie krótszej długości fali (około 50 000 razy krótszej niż światło). W tego typu urządzeniach zamiast soczewek szklanych stosuje się naturalnie soczewki elektroniczne (czyli pola o odpowiedniej konfiguracji). Wiązki elektronów nie mogą rozprzestrzeniać się bez rozproszenia nawet w ośrodkach gazowych, dlatego wewnątrz mikroskopu elektronowego na całej drodze elektronu należy utrzymać wysoką próżnię (ciśnienie do 10–6 mmHg lub 10–4 Pa). Mikroskopy elektronowe dzielimy ze względu na sposób zastosowania na dwie duże klasy: transmisyjne mikroskopy elektronowe (TEM) i skaningowe (SEM), czyli inaczej mikroskopy rastrowe (SEM). Zasadnicza różnica między nimi polega na tym, że w TEM wiązka elektronów przechodzi przez bardzo cienkie warstwy badanej substancji, o grubości mniejszej niż 1 mikron (jakby „przepuszczała” te warstwy), a w mikroskopach skaningowych wiązka elektronów jest sukcesywnie odbijany od małych obszarów powierzchni (strukturę powierzchni i jej charakterystyczne cechy można określić rejestrując elektrony odbite lub elektrony wtórne powstające podczas oddziaływania wiązki z powierzchnią).

Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) . Konstrukcja TEM jest podobna do konstrukcji konwencjonalnego mikroskopu optycznego (ryc. 1), zamiast promieni świetlnych wykorzystywane są tylko elektrony (czyli odpowiadające im fale). Pierwsze urządzenie tego typu powstało w 1932 roku. Niemieccy naukowcy M. Knoll i E. Ruska. W takim mikroskopie źródło światła zastępuje tzw. działo elektronowe (źródło elektronów). Źródłem elektronów jest zwykle podgrzewana katoda z sześcioborku wolframu lub lantanu. Katoda jest elektrycznie odizolowana od reszty urządzenia, a elektrony są przyspieszane przez silne pole elektryczne. Metalowa katoda 2 emituje elektrony, które zbierane są w wiązkę za pomocą elektrody skupiającej 3 i odbierają energię pod wpływem silnego pola elektrycznego w przestrzeni pomiędzy katodą a anodą 1. Aby wytworzyć to pole, stosuje się wysokie napięcie 100 kV lub więcej jest nakładane na elektrody. Wiązka elektronów wychodząca z działa elektronowego kierowana jest za pomocą soczewki kondensora 4 na badany obiekt, który rozprasza, odbija i pochłania elektrony. Są one skupiane przez soczewkę obiektywową 5, która tworzy obraz pośredni obiektu 7. Soczewka projekcyjna 6 ponownie zbiera elektrony i tworzy na ekranie luminescencyjnym drugi, jeszcze bardziej powiększony obraz obiektu, na który pod wpływem elektronów powstaje świetlisty obraz obiektu. Za pomocą kliszy fotograficznej umieszczonej pod ekranem uzyskuje się fotografię badanego obiektu.

Mikroskop(z greckiego mikros- mały i skopeo- patrzę) - urządzenie optyczne umożliwiające uzyskanie powiększonego obrazu małych obiektów i ich szczegółów niewidocznych gołym okiem.

Pierwszy znany mikroskop został stworzony w 1590 roku w Holandii przez dziedzicznych optyków Zachariasz I Hansa Jansena , który umieścił w jednym tubusie dwie soczewki wypukłe. Później Kartezjusz w swojej książce „Dioptria” (1637) opisał bardziej złożony mikroskop, składający się z dwóch soczewek - płasko wklęsłej (okular) i dwuwypukłej (obiektyw). Umożliwiło to dalsze udoskonalanie optyki Anthony'ego van Leeuwenhoeka w 1674 r. wykonał soczewki o powiększeniu wystarczającym do prowadzenia prostych obserwacji naukowych, a w 1683 r. po raz pierwszy opisał mikroorganizmy.

Nowoczesny mikroskop (ryc. 1) składa się z trzech głównych części: optycznej, oświetleniowej i mechanicznej.

Główne szczegóły część optyczna Mikroskop składa się z dwóch układów soczewek powiększających: okularu skierowanego w stronę oka badacza i soczewki skierowanej w stronę preparatu. Okulary Mają dwie soczewki, górna nazywana jest główną, a dolna nazywaną soczewką zbiorczą. Ramki okularów wskazują, co wytwarzają. zwiększyć(×5, ×7, ×10, ×15). Liczba okularów w mikroskopie może się różnić i dlatego jednooczny I obuoczny mikroskopy (przeznaczone do obserwacji obiektu jednym lub dwojgiem oczu), a także trinokulary , umożliwiająca podłączenie do mikroskopu systemów dokumentacji (kamer fotograficznych i wideo).

Soczewki to system soczewek zamkniętych w metalowej oprawce, z których przednia (przednia) soczewka wytwarza powiększenie, a znajdujące się za nią soczewki korekcyjne eliminują wady obrazu optycznego. Liczby na oprawce obiektywu wskazują również, co wytwarzają. zwiększyć (×8, ×10, ×40, ×100). Większość modeli przeznaczonych do badań mikrobiologicznych wyposażona jest w kilka soczewek o różnym stopniu powiększenia oraz mechanizm obrotowy przeznaczony do szybkiej wymiany - wieżyczka , często nazywany " wieżyczka ».

Część oświetleniowa ma za zadanie wytworzyć strumień świetlny pozwalający na oświetlenie obiektu w taki sposób, aby część optyczna mikroskopu spełniała swoje funkcje z niezwykłą precyzją. Część oświetleniowa mikroskopu światła przechodzącego bezpośrednio znajduje się za obiektem pod soczewką i obejmuje Źródło światła (lampa i zasilanie elektryczne) oraz układ optyczno-mechaniczny (kondensor, przysłona z regulacją pola i apertury). Skraplacz składa się z układu soczewek, których zadaniem jest zbieranie promieni pochodzących ze źródła światła w jednym punkcie - centrum , który musi znajdować się w płaszczyźnie rozważanego obiektu. Z kolei D membrana znajduje się pod kondensatorem i ma za zadanie regulować (zwiększać lub zmniejszać) przepływ promieni przechodzących ze źródła światła.

Część mechaniczna Mikroskop zawiera części, które łączą w sobie opisane powyżej części optyczne i oświetleniowe, a także umożliwiają umieszczenie i ruch badanego preparatu. W związku z tym część mechaniczna składa się z fusy mikroskop i uchwyt , do którego góry przymocowane są rura - wydrążony tubus przystosowany do pomieszczenia obiektywu, a także wspomnianej wieżyczki. Poniżej jest scena , na którym mocowane są szkiełka z badanymi próbkami. Stolik można przesuwać w poziomie za pomocą odpowiedniego urządzenia, a także w górę i w dół, co pozwala na regulację ostrości obrazu za pomocą brutto (makrometryczny) I śruby precyzyjne (mikrometryczne).

Zwiększyć, wytwarzany przez mikroskop, zależy od iloczynu powiększenia obiektywu i powiększenia okularu. Oprócz mikroskopii pola świetlnego w specjalnych metodach badawczych szeroko stosowane są: mikroskopia ciemnego pola, mikroskopia fazowo-kontrastowa, luminescencyjna (fluorescencyjna) i elektronowa.

Podstawowy(własny) fluorescencja zachodzi bez specjalnego leczenia lekami i jest nieodłącznym elementem wielu substancji biologicznie czynnych, takich jak aminokwasy aromatyczne, porfiryny, chlorofil, witaminy A, B2, B1, niektóre antybiotyki (tetracyklina) i substancje chemioterapeutyczne (akrychin, rivanol). Wtórny (wywołany) fluorescencja powstaje w wyniku obróbki mikroskopijnych obiektów barwnikami fluorescencyjnymi - fluorochromami. Niektóre z tych barwników są rozproszone w komórkach, inne selektywnie wiążą się z określonymi strukturami komórkowymi, a nawet z określonymi substancjami chemicznymi.

Aby przeprowadzić tego typu mikroskopię, specjalne mikroskopy luminescencyjne (fluorescencyjne). , różniący się od konwencjonalnego mikroskopu świetlnego obecnością dużej mocy źródło światła (ultrawysokociśnieniowa lampa rtęciowo-kwarcowa lub halogenowa lampa kwarcowa), emitująca głównie w zakresie długofalowego ultrafioletu lub krótkich fal (niebiesko-fioletowego) widma widzialnego.

Źródło to służy do wzbudzenia fluorescencji, zanim emitowane przez nie światło przejdzie przez specjalny element ekscytujący (niebiesko-fioletowy) filtr światła i znajduje odzwierciedlenie ingerencja rozdzielacz wiązki nagrywać , prawie całkowicie odcinając promieniowanie o większej długości fali i przepuszczając tylko tę część widma, która wzbudza fluorescencję. Jednocześnie w nowoczesnych modelach mikroskopów fluorescencyjnych ekscytujące promieniowanie uderza w preparat przez soczewkę (!) Po wzbudzeniu fluorescencji powstałe światło ponownie wchodzi do soczewki, po czym przechodzi przez tę umieszczoną przed okularem zamykający (żółty) filtr światła , odcinając krótkofalowe promieniowanie ekscytujące i przesyłając światło luminescencyjne z leku do oka obserwatora.

Ze względu na zastosowanie takiego układu filtrów świetlnych intensywność świecenia obserwowanego obiektu jest zwykle niewielka, dlatego mikroskopia fluorescencyjna powinna być wykonywana w specjalnych warunkach. zaciemnione pokoje .

Ważnym wymogiem przy wykonywaniu tego typu mikroskopii jest także zastosowanie zanurzenie niefluorescencyjne I załączenie mediów . W szczególności, aby wygasić wewnętrzną fluorescencję cedrowego lub innego olejku immersyjnego, dodaje się do niego niewielkie ilości nitrobenzenu (od 2 do 10 kropli na 1 g). Z kolei jako podłoża zawierające leki można zastosować roztwór buforowy gliceryny, a także niefluorescencyjne polimery (polistyren, alkohol poliwinylowy). W przeciwnym razie przy wykonywaniu mikroskopii luminescencyjnej stosuje się zwykłe szkiełka i szkiełka nakrywkowe, które przepuszczają promieniowanie w wykorzystywanej części widma i nie mają własnej luminescencji.

W związku z tym ważnymi zaletami mikroskopii fluorescencyjnej są:

1) obraz kolorowy;

2) wysoki stopień kontrastu obiektów samoświecących na czarnym tle;

3) możliwość badania struktur komórkowych selektywnie absorbujących różne fluorochromy, będące specyficznymi wskaźnikami cytochemicznymi;

4) umiejętność określenia zmian funkcjonalnych i morfologicznych w komórkach w dynamice ich rozwoju;

5) możliwość specyficznego barwienia mikroorganizmów (za pomocą immunofluorescencji).

Mikroskopia elektronowa

Stworzono teoretyczne podstawy wykorzystania elektronów do obserwacji obiektów mikroskopowych W. Hamiltona , który ustalił analogię pomiędzy przechodzeniem promieni świetlnych w ośrodkach optycznie niejednorodnych a trajektoriami cząstek w polach siłowych, a także de Broglie’a , który wysunął hipotezę, że elektron ma zarówno właściwości korpuskularne, jak i falowe.

Ponadto, ze względu na wyjątkowo krótką długość fali elektronów, która maleje wprost proporcjonalnie do przyłożonego napięcia przyspieszającego, teoretycznie obliczona limit rozdzielczości , który charakteryzuje zdolność urządzenia do oddzielnego wyświetlania małych, maksymalnie położonych szczegółów obiektu, dla mikroskopu elektronowego wynosi 2-3 Å ( Angstrem , gdzie 1Å=10 -10 m), czyli kilka tysięcy razy więcej niż w mikroskopie optycznym. Pierwszy obraz obiektu utworzonego przez wiązki elektronów uzyskano w 1931 roku. niemieccy naukowcy M. Knollem I E. Ruska .

W konstrukcjach nowoczesnych mikroskopów elektronowych źródłem elektronów jest metal (zwykle wolfram), z którego po podgrzaniu do 2500 ºС powstaje emisja termojonowa emitowane są elektrony. Za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych powstają przepływ elektronów Możesz przyspieszać i zwalniać, a także odchylać się w dowolnym kierunku i skupiać. Zatem rolę soczewek w mikroskopie elektronowym pełni zespół odpowiednio zaprojektowanych urządzeń magnetycznych, elektrostatycznych i kombinowanych zwanych „ soczewki elektroniczne” .

Warunkiem koniecznym przemieszczania się elektronów w postaci wiązki na dużą odległość jest także wytworzenie próżnia , ponieważ w tym przypadku średnia swobodna droga elektronów między zderzeniami z cząsteczkami gazu będzie znacznie przekraczać odległość, na jaką muszą się one poruszać. W tym celu wystarczy utrzymać w komorze roboczej podciśnienie rzędu 10 -4 Pa.

Ze względu na charakter badanych obiektów mikroskopy elektronowe dzielą się na półprzezroczysty, odblaskowy, emisyjny, rastrowy, cień I lustro , spośród których dwa pierwsze są najczęściej używane.

Konstrukcja optyczna transmisyjny (transmisyjny) mikroskop elektronowy jest całkowicie równoważny odpowiedniej konstrukcji mikroskopu optycznego, w którym wiązka światła jest zastępowana wiązką elektronów, a układy soczewek szklanych są zastępowane układami soczewek elektronowych. W związku z tym transmisyjny mikroskop elektronowy składa się z następujących głównych elementów: system oświetlenia, kamera obiektowa, system ustawiania ostrości I ostatni blok rejestracji obrazu , składający się z kamery i ekranu fluorescencyjnego.

Wszystkie te węzły są ze sobą połączone, tworząc tzw. „kolumnę mikroskopową”, wewnątrz której utrzymywana jest próżnia. Kolejnym ważnym wymaganiem dla badanego obiektu jest jego grubość mniejsza niż 0,1 mikrona. Ostateczny obraz obiektu powstaje po odpowiednim skupieniu na nim przechodzącej przez niego wiązki elektronów Film fotograficzny Lub ekran fluorescencyjny , pokryty specjalną substancją - luminoforem (podobnym do ekranu w kineskopach telewizyjnych) i zamieniający obraz elektroniczny na widzialny.

W tym przypadku powstawanie obrazu w transmisyjnym mikroskopie elektronowym wiąże się głównie z różnym stopniem rozpraszania elektronów przez różne obszary badanej próbki oraz, w mniejszym stopniu, z różnicami w absorpcji elektronów przez te obszary. Kontrast można także zwiększyć, korzystając z opcji „ barwniki elektroniczne „(czterotlenek osmu, uranyl itp.), selektywnie wiążący się z pewnymi obszarami obiektu. Zapewniają to nowoczesne transmisyjne mikroskopy elektronowe, zaprojektowane w podobny sposób maksymalne użyteczne powiększenie aż do 400 000 razy, co odpowiada rezolucja przy 5,0 Å. Nazywa się drobną strukturę komórek bakteryjnych ujawnioną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej ultrastruktura .

W odblaskowy (skaningowy) mikroskop elektronowy obraz tworzony jest za pomocą elektronów odbitych (rozproszonych) przez warstwę powierzchniową obiektu, gdy jest on naświetlany pod niewielkim kątem (około kilku stopni) do powierzchni. W związku z tym powstawanie obrazu wynika z różnicy w rozpraszaniu elektronów w różnych punktach obiektu w zależności od jego mikrorzeźby powierzchni, a sam wynik takiej mikroskopii pojawia się w postaci struktury powierzchni obserwowanego obiektu. Kontrast można zwiększyć poprzez napylanie cząstek metalu na powierzchnię obiektu. Osiągana rozdzielczość mikroskopów tego typu wynosi około 100 Å.

Przeznaczony do tworzenia powiększonych, dwuwymiarowych obrazów wykonywanych w płaszczyznach ogniskowych próbki rozmieszczonych sekwencyjnie wzdłuż osi optycznej, co zapewnia możliwość dwu- i trójwymiarowego badania drobnych szczegółów strukturalnych próbki. Elementy optyczne osadzone są na trwałej, ergonomicznej podstawie, umożliwiającej szybką wymianę, precyzyjne centrowanie i staranne ustawienie optycznie połączonych podzespołów. Razem elementy optyczne i mechaniczne mikroskopu, w tym próbka umieszczona pomiędzy szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym, tworzą układ optyczny, którego oś środkowa przechodzi przez podstawę i stojak mikroskopu.

Układ optyczny mikroskopu składa się zwykle z oświetlacza (w tym źródła światła i soczewki zbierającej), kondensora, próbki, obiektywu, okularu i fotodetektora, którym może być kamera lub oko obserwatora. Mikroskopy badawcze zawierają również urządzenie do wstępnego przetwarzania wiązki światła, zwykle umieszczone pomiędzy oświetlaczem a kondensorem, oraz dodatkowy fotodetektor lub filtry umieszczone pomiędzy obiektywem a okularem lub kamerą. Skoordynowane działanie fotodetektora i urządzeń do wstępnego przetwarzania wiązki zapewnia zmiany kontrastu obrazu w funkcji częstotliwości przestrzennej, fazy, polaryzacji, absorpcji, fluorescencji, oświetlenia poza osią i/lub innych właściwości próbki i warunków oświetleniowych. Ale nawet bez dodatkowych urządzeń do przetwarzania wiązki oświetlenia i filtrowania fal tworzących obraz, większość nawet podstawowych konfiguracji mikroskopowych ma pewien stopień naturalnego filtrowania.

Wstęp

Nowoczesne mikroskopy złożone służą do tworzenia powiększonych, dwuwymiarowych obrazów uzyskiwanych w płaszczyznach ogniskowych próbki rozmieszczonych sekwencyjnie wzdłuż osi optycznej, co zapewnia możliwość dwu- i trójwymiarowego badania drobnych szczegółów strukturalnych próbki.

Większość mikroskopów jest wyposażona w mechanizm ruchu stolika, który pozwala mikroskopowi precyzyjnie ustawić, zorientować i ustawić ostrość preparatu w celu optymalizacji obserwacji i obrazowania. Natężenie oświetlenia i droga promieni w mikroskopie są kontrolowane i kontrolowane poprzez umieszczenie przesłon, zwierciadeł, pryzmatów, rozdzielaczy wiązki i innych elementów optycznych w określonych pozycjach, uzyskując w ten sposób wymaganą jasność i kontrast próbki.

Rysunek 1 przedstawia mikroskop Nikon Eclipse E600 z tubusem trójokularowym i aparatem cyfrowym DXM-1200 do rejestracji obrazu. Oświetlenie zapewnia lampa halogenowa z żarnikiem wolframowym umieszczona w zespole lampy, której światło najpierw przechodzi przez soczewkę zbierającą, a następnie wchodzi na ścieżkę optyczną u podstawy mikroskopu. Wiązka światła emitowana przez żarówkę jest modyfikowana przez szereg filtrów umieszczonych również u podstawy mikroskopu, po czym odbita od zwierciadła pada przez przesłonę polową na kondensator. Stożek światła utworzony przez kondensor oświetla próbkę znajdującą się na stoliku mikroskopu i dociera do obiektywu. Za soczewką wiązka światła jest rozdzielana przez rozdzielacz wiązki/pryzmat i kierowana albo do okularu, gdzie powstaje obraz wirtualny, albo do soczewki projekcyjnej trójokularowej rurki pośredniej w celu utworzenia obrazu cyfrowego na matrycy fotodiody CCD systemu cyfrowej rejestracji i wizualizacji obrazu.

Elementy optyczne nowoczesnych mikroskopów osadzone są na trwałej, ergonomicznej podstawie, która pozwala na szybką wymianę, precyzyjne centrowanie i staranną regulację optycznie połączonych podzespołów. Razem elementy optyczne i mechaniczne mikroskopu, w tym próbka umieszczona pomiędzy szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym, tworzą układ optyczny, którego oś środkowa przechodzi przez podstawę i stojak mikroskopu.

Układ optyczny mikroskopu zwykle składa się z oświetlacza (w tym źródła światła i soczewki zbierającej), kondensora, próbki, soczewki, okularu i fotodetektora, którym może być kamera lub oko obserwatora (tabela 1).
Mikroskopy badawcze zawierają także urządzenie do wstępnego przetwarzania wiązki światła, zwykle umieszczone pomiędzy oświetlaczem a kondensorem, oraz dodatkowy fotodetektor lub filtry światła umieszczone pomiędzy obiektywem a okularem lub kamerą. Skoordynowane działanie fotodetektora i urządzeń do wstępnego przetwarzania wiązki zapewnia zmiany kontrastu obrazu w funkcji częstotliwości przestrzennej, fazy, polaryzacji, absorpcji, fluorescencji, oświetlenia poza osią i/lub innych właściwości próbki i warunków oświetleniowych. Ale nawet bez dodatkowych urządzeń do przetwarzania wiązki oświetlenia i filtrowania fal tworzących obraz, większość podstawowych konfiguracji mikroskopowych ma pewien stopień naturalnego filtrowania.

Tabela 1. Elementy układu optycznego mikroskopu.

Element mikroskopu	Elementy i cechy
Iluminator	Źródło światła, soczewka skupiająca, przysłona polowa, filtry termiczne, filtry poziomujące, dyfuzor, filtry o neutralnej gęstości
Urządzenie do wstępnego przetwarzania wiązki	Przysłona irysowa kondensora, przysłona ciemnego pola, maska cienia, pierścienie fazowe, przysłona szczelinowa pozaosiowa, pryzmat Nomarskiego, filtr wzbudzenia fluorescencji
Skraplacz	Apertura numeryczna, ogniskowa, aberracje, transmisja światła, ośrodek immersyjny, odległość robocza
Próbka	Grubość szkiełka, grubość szkiełka nakrywkowego, ośrodek immersyjny, absorpcja, transmisja, dyfrakcja, fluorescencja, opóźnienie, dwójłomność
Obiektyw	Powiększenie, apertura numeryczna, ogniskowa, ośrodek immersyjny, aberracje, transmisja światła, funkcja przenoszenia optycznego, odległość robocza
Filtr obrazu	Kompensator, analizator, pryzmat Nomarskiego, przesłona soczewki, płytka fazowa, filtr SSEE, płytka modulacyjna, transmisja światła, wybór długości fali, filtr odcinający fluorescencję
Okular	Powiększenie, aberracje, wielkość pola, przesunięcie oka
Detektor	Oko ludzkie, fotoemulsja, fotopowielacz, matryca fotodiodowa, kamera wideo

Podczas gdy niektóre elementy optyczne mikroskopu pełnią rolę elementów tworzących obraz, inne służą do różnych modyfikacji wiązki oświetlającej, a także pełnią funkcje filtrujące i transmisyjne. Elementy tworzące obraz układu optycznego mikroskopu to soczewka skupiająca (umieszczona w oświetlaczu lub obok niego), kondensor, obiektyw, tubus okularu (lub okular) oraz elementy refrakcyjne ludzkiego oka lub obiektywu aparatu. Chociaż niektóre z tych składników nie są typowo składnikami tworzącymi obraz, ich charakterystyka ma ogromne znaczenie przy określaniu jakości końcowego obrazu mikroskopowego.

Droga fal świetlnych przez idealną soczewkę

Zrozumienie roli poszczególnych soczewek tworzących elementy układu optycznego ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia procesu obrazowania w mikroskopie. Najprostszym elementem tworzącym obraz jest soczewka idealna (rys. 2) – idealnie skorygowana, wolna od aberracji i skupiająca światło w jednym punkcie. Równoległa, przyosiowa wiązka światła załamana w soczewce zbierającej skupia się w swoim ognisku lub ognisku (na ryc. 2 jest to oznaczone napisem Centrum). Takie soczewki są często nazywane pozytywny, ponieważ sprzyjają szybszemu zbieganiu się zbieżnej (zbieżnej) wiązki światła i spowalniają rozbieżność wiązki rozbieżnej. Światło ze źródła punktowego znajdującego się w ognisku soczewki wyłania się z niego w postaci równoległej, przyosiowej wiązki (kierunek od prawej do lewej na ryc. 2). Nazywa się odległość między soczewką a jej ogniskiem długość ogniskowa soczewki (oznaczone literą f na rysunku 2).

Zjawiska optyczne są często opisywane w kategoriach teorii kwantowej lub optyki falowej, w zależności od rozpatrywanego problemu. Kiedy światło przechodzi przez soczewkę, można pominąć jego właściwości falowe i założyć, że porusza się po liniach prostych, zwykle zwanych promieniami. Proste diagramy lub ścieżki promieni często wystarczają do wyjaśnienia wielu ważnych aspektów i koncepcji mikroskopii, w tym refrakcji, ogniskowej, powiększenia, obrazowania i apertur. W innych przypadkach wygodniej jest uważać fale świetlne za składające się z pojedynczych cząstek (kwantów), zwłaszcza gdy światło powstaje w wyniku zdarzenia mechaniki kwantowej lub jest przekształcane w inną formę energii. W naszej dyskusji promienie przyosiowe przechodzące przez soczewki optyczne będą rozpatrywane zarówno w kategoriach optyki falowej, jak i geometrycznej (promieniowej) (diagramy promieni, na których promienie rozchodzą się od lewej do prawej). Przyosiowe (lub przyosiowe) to promienie świetlne przechodzące blisko osi optycznej; w tym przypadku wartości kątów padania i załamania wyrażone w radianach można uznać w przybliżeniu za równe wartościom ich sinusów.

W równoległej wiązce światła tworzą się pojedyncze fale monochromatyczne grupa fal, wektory elektryczne i magnetyczne, w których oscylują w fazie i formie przód fali; w tym przypadku kierunek jego propagacji jest prostopadły do kierunku oscylacji. Przechodząc przez soczewkę idealną, fala płaska przekształca się w falę kulistą, której środek znajduje się w ognisku ( Centrum) soczewki (ryc. 2). Fale świetlne skupione w ognisku interferują, wzmacniając się nawzajem. I odwrotnie, sferyczne czoło fali odbiegające od ogniska idealnej soczewki jest przez nią przekształcane w falę płaską (propagacja od prawej do lewej na rysunku 2). Każdy promień fali płaskiej załamuje się w soczewce z niewielką różnicą w stosunku do pozostałych, ponieważ pada na jej powierzchnię pod nieco innym kątem. Na wyjściu z obiektywu zmienia się również kierunek wiązki światła. W rzeczywistych systemach kąt załamania światła i ognisko soczewki lub grupy soczewek zależą od grubości, geometrii, współczynnika załamania światła i rozproszenia każdego elementu układu.

Część elektryczna mikroskopu

W przeciwieństwie do szkła powiększającego, mikroskop ma co najmniej dwa poziomy powiększenia. Części funkcjonalne, konstrukcyjne i technologiczne mikroskopu mają za zadanie zapewnić działanie mikroskopu i uzyskanie stabilnego, jak najdokładniejszego, powiększonego obrazu obiektu. Tutaj przyjrzymy się budowie mikroskopu i spróbujemy opisać główne części mikroskopu.

Funkcjonalnie urządzenie mikroskopowe jest podzielone na 3 części:

1. Część oświetleniowa

Część oświetleniowa mikroskopu obejmuje źródło światła (lampę i zasilacz elektryczny) oraz układ optyczno-mechaniczny (kolektor, kondensator, regulowane pole i apertura/przesłony irysowe).

2. Część odtwarzająca

Zaprojektowany do odtworzenia obiektu w płaszczyźnie obrazu z jakością obrazu i powiększeniem wymaganymi do badań (tj. do skonstruowania obrazu, który odtworzy obiekt tak dokładnie, jak to możliwe i ze wszystkimi szczegółami, z rozdzielczością, powiększeniem, kontrastem i odwzorowaniem kolorów odpowiadającymi optyka mikroskopu).
Część odtwarzająca stanowi pierwszy stopień powiększenia i znajduje się za obiektem w płaszczyźnie obrazu mikroskopowego.
Część odtwarzająca zawiera soczewkę i pośredni układ optyczny.

Nowoczesne mikroskopy najnowszej generacji oparte są na układach soczewek optycznych korygowanych na nieskończoność. Wymaga to dodatkowo zastosowania tzw. układów tubowych, które „zbierają” równoległe wiązki światła wychodzące z soczewki w płaszczyźnie obrazu mikroskopu.

3. Część wizualizacyjna

Przeznaczony do uzyskania rzeczywistego obrazu obiektu na siatkówce oka, kliszy fotograficznej lub kliszy, na ekranie telewizora lub monitora komputerowego z dodatkowym powiększeniem (drugi stopień powiększenia).
Część obrazowa znajduje się pomiędzy płaszczyzną obrazu obiektywu a oczami obserwatora (aparat cyfrowy).
Część obrazująca składa się z jednookularowego, dwuokularowego lub trójokularowego nasadki wzrokowej z systemem obserwacyjnym (okulary działające jak szkło powiększające).
Dodatkowo w tej części znajdują się dodatkowe systemy powiększeń (hurtownia powiększeń/systemy wymiany); załączniki do projekcji, w tym załączniki do dyskusji dla dwóch lub więcej obserwatorów; urządzenia do rysowania; systemy analizy i dokumentacji obrazu wraz z odpowiednimi adapterami do aparatów cyfrowych.

Układ głównych elementów mikroskopu optycznego

Z konstrukcyjnego i technologicznego punktu widzenia mikroskop składa się z następujących części:

mechaniczny;
optyczny;
elektryczny.

1. Część mechaniczna mikroskopu

Urządzenie mikroskopowe włącza się sam statyw, który jest głównym blokiem konstrukcyjnym i mechanicznym mikroskopu. W skład statywu wchodzą następujące główne bloki: baza I uchwyt na rurkę.

Baza to bryła, na której osadzony jest cały mikroskop i stanowi jedną z głównych części mikroskopu. W prostych mikroskopach na podstawie instaluje się lustra oświetleniowe lub oświetlacze górne. W bardziej skomplikowanych modelach system oświetlenia jest wbudowany w podstawę bez zasilacza lub z zasilaczem.

Rodzaje podstaw mikroskopowych:

podstawa z podświetlanym lustrem;
tzw. oświetlenie „krytyczne” lub uproszczone;
Oświetlenie Koehlera.

zespół do wymiany obiektywu, który ma następujące opcje konstrukcyjne - urządzenie obrotowe, urządzenie gwintowane do wkręcania obiektywu, „sanki” do bezgwintowego mocowania soczewek za pomocą specjalnych prowadnic;
mechanizm ogniskujący do zgrubnej i precyzyjnej regulacji ostrości mikroskopu - mechanizm ogniskowania ruchu soczewek lub stopni;
punkt mocowania wymiennych stołów obiektowych;
zespół montażowy do ogniskowania i ruchu centrującego kondensora;
punkt mocowania wymiennych przystawek (wizualnych, fotograficznych, telewizyjnych, różnych urządzeń nadawczych).

Mikroskopy mogą wykorzystywać stojaki do mocowania elementów (na przykład mechanizm ogniskowania w mikroskopach stereoskopowych lub uchwyt oświetlacza w niektórych modelach mikroskopów odwróconych).

Czysto mechanicznym elementem mikroskopu jest scena, przeznaczony do mocowania lub mocowania obiektu obserwacyjnego w określonej pozycji. Stoły można ustawiać na stałe, koordynować i obracać (centrowane i niecentrowane).

2. Optyka mikroskopu (część optyczna)

Elementy optyczne i akcesoria pełnią główną funkcję mikroskopu - tworzenie powiększonego obrazu obiektu o wystarczającym stopniu niezawodności pod względem kształtu, proporcji wielkości elementów składowych i koloru. Ponadto optyka musi zapewniać jakość obrazu spełniającą cele badania i wymagania metod analizy.
Głównymi elementami optycznymi mikroskopu są elementy optyczne tworzące układy oświetleniowe (w tym kondensor), obserwacyjne (okulary) i odtwarzające (w tym soczewki) mikroskopu.

Cele mikroskopu

— są układami optycznymi przeznaczonymi do konstruowania obrazu mikroskopowego w płaszczyźnie obrazu przy odpowiednim powiększeniu, rozdzielczości elementu i dokładności odwzorowania kształtu i koloru przedmiotu badań. Obiektywy są jedną z głównych części mikroskopu. Mają złożoną konstrukcję optyczno-mechaniczną, która obejmuje kilka pojedynczych soczewek i elementów sklejonych ze sobą z 2 lub 3 soczewek.
O liczbie soczewek decyduje zakres zadań, które soczewka rozwiązuje. Im wyższa jakość obrazu wytwarzana przez obiektyw, tym bardziej złożona jest jego konstrukcja optyczna. Całkowita liczba soczewek w obiektywie złożonym może wynosić do 14 (np. może to dotyczyć obiektywu planochromatycznego o powiększeniu 100x i aperturze numerycznej 1,40).

Obiektyw składa się z części przedniej i tylnej. Soczewka przednia (lub układ soczewek) jest zwrócona w stronę preparatu i odgrywa kluczową rolę w konstruowaniu obrazu o odpowiedniej jakości, od niej zależy odległość robocza i apertura numeryczna obiektywu. Kolejna część w połączeniu z częścią przednią zapewnia wymagane powiększenie, ogniskową i jakość obrazu, a także określa wysokość obiektywu i długość tubusu mikroskopu.

Klasyfikacja soczewek

Klasyfikacja soczewek jest znacznie bardziej skomplikowana niż klasyfikacja mikroskopów. Soczewki dzielą się ze względu na zasadę obliczonej jakości obrazu, cechy parametryczne i projektowo-technologiczne, a także metody badawcze i kontrastowe.

Zgodnie z zasadą obliczonej jakości obrazu soczewki mogą być:

achromatyczny;
apochromatyczny;
soczewki o płaskim polu (plan).

Soczewki achromatyczne.

Soczewki achromatyczne przeznaczone są do stosowania w zakresie widmowym 486-656 nm. Korekta ewentualnych aberracji (achromatyzacja) dokonywana jest dla dwóch długości fali. Soczewki te eliminują aberrację sferyczną, aberrację położenia chromatycznego, komę, astygmatyzm i częściowo aberrację sferochromatyczną. Obraz obiektu ma lekko niebieskawo-czerwonawy odcień.

Soczewki apochromatyczne.

Cele apochromatyczne mają rozszerzony obszar widmowy, a achromatyzacja jest przeprowadzana przy trzech długościach fal. Jednocześnie oprócz chromatyzmu pozycyjnego, aberracji sferycznej, komy i astygmatyzmu, całkiem dobrze korygowane jest także widmo wtórne i aberracja sferochromatyczna, dzięki wprowadzeniu do konstrukcji soczewek kryształowych i specjalnych okularów. W porównaniu z soczewkami achromatycznymi, soczewki te mają zazwyczaj wyższą aperturę numeryczną, zapewniają ostrzejsze obrazy i dokładnie odtwarzają kolor obiektu.

Półapochromaty Lub mikrofluary.

Nowoczesne obiektywy o średniej jakości obrazu.

Obiektywy planszowe.

W obiektywach planowych skorygowano krzywiznę obrazu w całym polu, co zapewnia ostry obraz obiektu w całym polu obserwacji. Obiektywy planowe są zwykle używane w fotografii, przy czym najskuteczniejsze są apochromaty planowe.

Zapotrzebowanie na tego typu obiektywy wzrasta, są one jednak dość drogie ze względu na konstrukcję optyczną wykorzystującą płaskie pole obrazu i zastosowane nośniki optyczne. Dlatego mikroskopy rutynowe i robocze wyposażane są w tzw. soczewki ekonomiczne. Należą do nich soczewki o lepszej jakości obrazu w całym polu widzenia: achromaty (LEICA), achromaty i achropłany CP (CARL ZEISS), stigmachromaty (LOMO).

Według charakterystyk parametrycznych soczewki dzielą się w następujący sposób:

obiektywy o skończonej długości tubusu (np. 160 mm) oraz obiektywy skorygowane o długość tubusu „infinity” (np. z dodatkowym układem tubusów o ogniskowej mikroskopu 160 mm);
małe obiektywy (do 10x); średnie (do 50x) i duże (ponad 50x) powiększenia, a także soczewki o ultra dużym powiększeniu (ponad 100x);
soczewki o małej (do 0,25), średniej (do 0,65) i dużej (powyżej 0,65) aperturze numerycznej, a także soczewki o zwiększonej (w porównaniu do konwencjonalnej) apertury numerycznej (na przykład soczewki korekcyjne apochromatyczne, a także specjalne soczewki do mikroskopów fluorescencyjnych);
soczewki o zwiększonych (w porównaniu do konwencjonalnych) odległościach roboczych, a także o dużych i bardzo długich odległościach roboczych (soczewki do pracy w mikroskopach odwróconych). Odległość robocza to wolna odległość pomiędzy obiektem (płaszczyzną szkła nakrywkowego) a dolną krawędzią oprawki (soczewką, jeśli wystająca) przedniego elementu soczewki;
soczewki umożliwiające obserwację w normalnym polu liniowym (do 18 mm); obiektywy szerokokątne (do 22,5 mm); obiektywy ultraszerokokątne (ponad 22,5 mm);
soczewki mają standardową (45 mm, 33 mm) i niestandardową wysokość.

Wysokość - odległość od płaszczyzny odniesienia soczewki (płaszczyzny styku wkręcanej soczewki z urządzeniem obrotowym) do płaszczyzny przedmiotu pod mikroskopem ogniskowym jest wartością stałą i zapewnia parafokalność zestawu soczewki o podobnej wysokości i różnych powiększeniach zamontowane w urządzeniu obrotowym. Innymi słowy, jeśli zastosujemy obiektyw o jednym powiększeniu, aby uzyskać ostry obraz obiektu, to przy przejściu do kolejnych powiększeń obraz obiektu pozostanie ostry w głębi ostrości obiektywu.

Zgodnie z projektem i cechami technologicznymi istnieje następujący podział:

obiektywy z oprawką sprężynową (od apertury numerycznej 0,50) i bez niej;
soczewki posiadające wewnątrz przysłonę irysową do zmiany apertury numerycznej (np. w soczewkach o zwiększonej aperturze numerycznej, w soczewkach do światła przechodzącego w celu realizacji metody ciemnego pola, w soczewkach spolaryzowanych w świetle odbitym);
soczewki z oprawką korekcyjną (kontrolną), która zapewnia ruch elementów optycznych wewnątrz obiektywu (np. w celu dostosowania jakości obrazu obiektywu podczas pracy z różnymi grubościami szkieł nakrywkowych lub z różnymi płynami immersyjnymi, a także do zmiany powiększenie podczas płynnej – pankratycznej – zmiany powiększenia) i bez niej.

Zapewnienie badań i metod kontrastujących soczewki można podzielić w następujący sposób:

obiektywy współpracujące z szybą osłonową i bez niej;
soczewki światła przechodzącego i odbitego (bezodblaskowe); soczewki luminescencyjne (z minimalną luminescencją wewnętrzną); soczewki polaryzacyjne (bez naprężenia szkła w elementach optycznych, tj. bez wprowadzania własnej depolaryzacji); soczewki fazowe (posiadające element fazowy - półprzezroczysty pierścień wewnątrz soczewki); Soczewki DIC pracujące metodą różnicowo-kontrastowo-interferencyjną (polaryzujące elementem pryzmatycznym); episoczewki (soczewki ze światłem odbitym, przeznaczone do dostarczania metod jasnego i ciemnego pola, mają w swojej konstrukcji specjalnie zaprojektowane oświetlające epi-lustra);
soczewki immersyjne i nieimmersyjne.

Zanurzenie ( z łac. immersio – zanurzenie) to ciecz wypełniająca przestrzeń pomiędzy obiektem obserwacji a specjalnym obiektywem immersyjnym (kondensatorem i szkiełkiem). Stosowane są głównie trzy rodzaje cieczy immersyjnych: immersja w oleju (MI/Oil), immersja w wodzie (WI/W) i immersja w glicerynie (GI/Glyc), przy czym ta ostatnia jest stosowana głównie w mikroskopii ultrafioletowej.
Immersję stosuje się w przypadkach, gdy konieczne jest zwiększenie rozdzielczości mikroskopu lub jej zastosowanie wymaga proces technologiczny mikroskopii. To się stało:

zwiększenie widoczności poprzez zwiększenie różnicy między współczynnikiem załamania światła ośrodka i obiektu;
zwiększenie głębokości oglądanej warstwy, która zależy od współczynnika załamania światła ośrodka.

Ponadto płyn immersyjny może zmniejszyć ilość rozproszonego światła, eliminując odblaski obiektu. Eliminuje to nieuniknioną utratę światła wpadającego do obiektywu.

Soczewki immersyjne. Jakość obrazu, parametry i konstrukcja optyczna soczewek immersyjnych są obliczane i dobierane z uwzględnieniem grubości warstwy immersyjnej, która jest traktowana jako dodatkowa soczewka o odpowiednim współczynniku załamania światła. Płyn immersyjny umieszczony pomiędzy przedmiotem a przednią częścią soczewki zwiększa kąt, pod jakim oglądany jest obiekt (kąt apertury). Apertura numeryczna soczewki bezimmersyjnej (suchej) nie przekracza 1,0 (rozdzielczość wynosi około 0,3 µm dla głównej długości fali); immersja - osiąga 1,40 w zależności od współczynnika załamania światła immersji i możliwości technologicznych wykonania przedniej soczewki (rozdzielczość takiej soczewki wynosi około 0,12 mikrona).
Obiektywy immersyjne o dużym powiększeniu mają krótką ogniskową 1,5–2,5 mm i swobodną odległość roboczą 0,1–0,3 mm (odległość od płaszczyzny preparatu do oprawy przedniej soczewki obiektywu).

Oznaczenia obiektywu.

Dane o każdym obiektywie są oznaczone na jego korpusie i wskazują następujące parametry:

powiększenie („x”-krotne, razy): 8x, 40x, 90x;
NA: 0,20; 0,65, przykład: 40/0,65 lub 40x/0,65;
dodatkowe oznaczenie literowe w przypadku stosowania obiektywu do różnych metod badawczych i kontrastowych: fazowe - Ф (Рп2 - liczba odpowiada oznaczeniu na specjalnym kondensorze lub wkładce), polaryzacyjne - П (Pol), luminescencyjne - Л (L), fazowe -luminescencyjne - FL ( PhL), EPI (Epi, HD) - epilens do pracy w świetle odbitym metodą ciemnego pola, różnicowy kontrast interferencyjny - DIC (DIC), przykład: 40x/0,65 F lub Ph2 40x/0,65;
oznaczenie rodzaju korekcji optycznej: apochromat - APO (APO), planchromat - PLAN (PL, Plan), planachromat - PLAN-APO (Plan-Aro), achromat ulepszony, semi-plan - CX - stigmachromat (Achrostigmat, CP- achromat, Achroplan), mikrofluar (semiplan-semi-apochromat) - SF lub M-FLUAR (MICROFLUAR, NEOFLUAR, NPL, FLUOTAR).

Okulary

Układy optyczne przeznaczone do konstruowania obrazu mikroskopowego na siatkówce oka obserwatora. Ogólnie rzecz biorąc, okulary składają się z dwóch grup soczewek: soczewki oka - znajdującej się najbliżej oka obserwatora - i soczewki polowej - znajdującej się najbliżej płaszczyzny, w której soczewka buduje obraz danego obiektu.

Okulary są klasyfikowane według tych samych grup cech, co soczewki:

okulary o działaniu kompensacyjnym (K - kompensują różnicę chromatyczną w powiększeniu obiektywu powyżej 0,8%) i niekompensacyjnym;
okulary o polu regularnym i płaskim;
okulary szerokokątne (z numerem okularu - iloczynem powiększenia okularu i jego pola liniowego - powyżej 180); ultraszerokokątny (o liczbie okularów większej niż 225);
okulary z rozszerzoną źrenicą do pracy w okularach lub bez;
okulary obserwacyjne, okulary projekcyjne, okulary fotograficzne, gamale;
okulary z celowaniem wewnętrznym (za pomocą ruchomego elementu wewnątrz okularu dokonuje się regulacji ostrości obrazu siatki lub płaszczyzny obrazu mikroskopu oraz płynnej, pankratycznej zmiany powiększenia okularu) i bez niego.

System oświetleniowy

System oświetlenia jest ważną częścią projekty mikroskopów i jest to układ soczewek, przysłon i luster (w razie potrzeby stosuje się te ostatnie), zapewniający równomierne oświetlenie obiektu i całkowite wypełnienie apertury obiektywu.
Układ oświetlenia mikroskopu światła przechodzącego składa się z dwóch części: kolektora i kondensatora.

Kolektor.
Dzięki wbudowanemu systemowi oświetlenia światłem przechodzącym, część kolektora znajduje się w pobliżu źródła światła u podstawy mikroskopu i ma na celu zwiększenie rozmiaru ciała świetlistego. Aby zapewnić regulację, kolektor może być ruchomy i poruszać się wzdłuż osi optycznej. Membrana polowa mikroskopu znajduje się w pobliżu kolektora.

Skraplacz.
Układ optyczny kondensora zaprojektowano tak, aby zwiększał ilość światła wpadającego do mikroskopu. Kondensor znajduje się pomiędzy przedmiotem (sceną) a oświetlaczem (źródłem światła).
Najczęściej w mikroskopach edukacyjnych i prostych kondensator może być nieusuwalny i nieruchomy. W innych przypadkach kondensor jest częścią wyjmowaną i podczas regulacji oświetlenia ma ruch skupiający wzdłuż osi optycznej i ruch centrujący prostopadle do osi optycznej.
Na kondensorze zawsze znajduje się świecąca przysłona irysowa.

Kondensator jest jednym z głównych elementów zapewniających działanie mikroskopu przy różnych metodach oświetlenia i kontrastu:

oświetlenie skośne (przesłona od krawędzi do środka i przemieszczenie przysłony oświetleniowej względem osi optycznej mikroskopu);
ciemne pole (maksymalna apertura od środka do krawędzi apertury oświetleniowej);
kontrast fazowy (oświetlenie pierścieniowe obiektu, podczas gdy obraz pierścienia świetlnego mieści się w pierścieniu fazowym soczewki).

Klasyfikacja kondensatorów jest zbliżony grupami cech do soczewek:

Kondensatory ze względu na jakość obrazu i rodzaj korekcji optycznej dzielą się na nieachromatyczne, achromatyczne, aplanatyczne i achromatyczno-aplanatyczne;
kondensory o małej aperturze numerycznej (do 0,30), średniej aperturze numerycznej (do 0,75), dużej aperturze numerycznej (powyżej 0,75);
skraplacze o regularnych, długich i bardzo długich dystansach roboczych;
kondensatory konwencjonalne i specjalne do różnych metod badawczych i kontrastowych;
Kondensor ma konstrukcję pojedynczą, ze składaną soczewką (przedni element lub obiektyw o dużym polu widzenia), z przykręcaną przednią soczewką.

kondensator Abbego- kondensor niekorygowany pod kątem jakości obrazu, składający się z 2 soczewek nieachromatycznych: jedna jest dwuwypukła, druga płasko-wypukła, zwrócona w stronę obiektu obserwacji (płaska strona tej soczewki skierowana jest do góry). Otwór kondensora, A = 1,20. Posiada przysłonę irysową.

Kondensator aplanatyczny- kondensor składający się z trzech soczewek ułożonych w następujący sposób: górna soczewka jest płasko-wypukła (płaska strona skierowana jest w stronę soczewki), następnie wklęsło-wypukłe i dwuwypukłe. Poprawiono kwestię aberracji sferycznej i komy. Otwór kondensora, A = 1,40. Posiada przysłonę irysową.

Kondensator achromatyczny- Kondensor w pełni skorygowany pod kątem aberracji chromatycznej i sferycznej.

Kondensator ciemnego pola- kondensator przeznaczony do uzyskania efektu ciemnego pola. Może być specjalny lub przekształcony ze zwykłego kondensora jasnego pola, instalując nieprzezroczysty dysk o określonym rozmiarze w płaszczyźnie przysłony irysowej kondensora.

Oznaczenie skraplacza.
Apertura numeryczna (podświetlenie) zaznaczona jest na przodzie kondensora.

3. Część elektryczna mikroskopu

Nowoczesne mikroskopy zamiast luster wykorzystują różnorodne źródła światła zasilane z sieci elektrycznej. Mogą to być zwykłe żarówki lub lampy halogenowe, ksenonowe lub rtęciowe. Coraz większą popularnością cieszy się także oświetlenie LED. Mają znaczne zalety w porównaniu z lampami konwencjonalnymi, takie jak trwałość, mniejsze zużycie energii itp. Do zasilania źródła światła stosuje się różne zasilacze, zapłonniki i inne urządzenia, które przekształcają prąd z sieci elektrycznej na odpowiedni do zasilania konkretnego źródło światła. Mogą to być również akumulatory, co pozwala na korzystanie z mikroskopów w terenie w przypadku braku punktu przyłączeniowego.